一、样品信息
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样品组分 |
结构式 |
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柠檬黄 |
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新红 |
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苋菜红 |
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靛蓝 |
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胭脂红 |
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日落黄 |
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诱惑红 |
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亮蓝 |
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参照《食品中合成着色剂的测定》（GB/T5009.35-2003），建立红酒中的合成着色剂的SPE-HPLC检测方法。
l 乙酸；
l 甲醇；
l 乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000mL；
l 氨水溶液：量取氨水2mL，加水至100mL，混匀；
l 甲醇/甲酸（6+4）溶液：量取甲醇60ml，甲酸40mL，混匀；
l 柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸，加水至100mL溶解，混匀；
l 无水乙醇-氨水溶液-水：量取无水乙醇70mL，氨水溶液20mL、水10mL，混匀；
l 水（PH=6.0）：水加柠檬酸溶液调节PH=6.0；
l 水（PH=4.0）：水加柠檬酸溶液调节PH=4.0；
l 水：超纯水
l 合成着色剂储备液：每1.0mL中含柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝各0.5mg，诱惑红0.1mg的水溶液；
l 合成着色剂使用液：上述合成着色剂储备液逐级稀释成每1.0mL中含柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝各5μg，诱惑红1μg的水溶液；
l Cleanert® JXA SPE小柱：规格为1g/6mL，使用前经5mL甲醇和5mL pH=6.0的水活化。
3.2.实验耗材
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名称 |
规格 |
订货号 |
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Venusil® XBP C18 |
5μm，100A，4.6*150mm |
VX951505-0 |
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保护柱芯 |
4.6*10mm，4/pk |
VX950105-0 |
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保护柱套 |
适用于4.6*10mm的保护柱芯 |
CH-100 |
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Cleanert® JXA |
1g/6mL，30/盒 |
JXA0006 |
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Hydrophilic PTFE |
0.45um，13mm，100/包 |
AS081345 |
取试样（某品牌红酒）20mL,加入合成着色剂混标溶液1.0mL，混匀，用10%氨水调节PH约6.0，将全部试样经过Cleanert® JXA柱，分别用水（PH=4.0）、甲醇/加酸（6+4）溶液6ml淋洗，再用10mL水淋洗，用乙醇-氨水溶液-水（7+2+1）6mL洗脱，收集洗脱液于50℃水浴蒸发至干，加水定容至1.0mL，经0.45μm滤膜过滤，待测。
色谱柱：Venusil® XBP C18，5μm；4.6*150mm；
流动相：A：0.02mol/L的乙酸铵溶液（乙酸调节pH=4）；
B：甲醇
流 速：1.0mL/min；
进样量：20μL；
波 长：254nm；
梯 度：
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时间 |
A% |
B% |
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0 |
95 |
5 |
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10 |
80 |
20 |
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18 |
40 |
60 |
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25 |
40 |
60 |
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25.01 |
95 |
5 |
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40 |
95 |
5 |
表1.添加5ppm混标峰面积数据
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样品组分 |
标品 |
标样过柱1 |
标样过柱2 |
红酒样品1 |
红酒样品2 |
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柠檬黄 |
318 |
320 |
315 |
294 |
324 |
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新红 |
471 |
474 |
461 |
482 |
473 |
|
苋菜红 |
266 |
269 |
262 |
277 |
279 |
|
靛蓝 |
314 |
282 |
279 |
273 |
275 |
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胭脂红 |
266 |
267 |
263 |
246 |
240 |
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日落黄 |
234 |
238 |
234 |
210 |
212 |
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诱惑红 |
33 |
33 |
33 |
35 |
34 |
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亮蓝 |
39 |
40 |
39 |
37 |
37 |
表2.添加5ppm混标回收率数据
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样品组分 |
标样过柱1（%） |
标样过柱2（%） |
红酒样品1（%） |
红酒样品2（%） |
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柠檬黄 |
100.6 |
99 |
92.5 |
102 |
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新红 |
100.6 |
97.8 |
102 |
100 |
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苋菜红 |
101 |
98.5 |
104 |
105 |
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靛蓝 |
89.8 |
88.8 |
86.9 |
87.5 |
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胭脂红 |
100.3 |
98.8 |
92.5 |
90.2 |
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日落黄 |
101 |
100 |
90 |
90.6 |
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诱惑红 |
100 |
100 |
106 |
103 |
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亮蓝 |
102 |
100 |
95 |
95 |
五、实验结论
实验结果表明，Cleanert® JXA小柱和Venusil® XBP C18液相色谱柱可以用于红酒中的合成着色剂的检测，该方法快速、准确。
红酒样品呈弱酸性，在上样之前要将其pH值调节至6左右，保证小柱可对合成着色剂有良好地吸附；
若样品酒精度过高，建议在上样前对样品进行除醇处理；
SPE小柱净化过程中，要注意对流速的控制，建议控制在1mL/min左右；
洗脱液氮吹复溶后，应选用水系滤膜过滤，防止因滤膜吸附造成样品的损失，建议选用Agela Hydrophilic PTFE滤头。
附录：
图1 5ppm混标溶液
图2 5ppm混标过柱1
图3 5ppm混标过柱2
图4 红酒空白图谱
图5 5ppm基质加标1
图6 5ppm基质加标2
